Monografías de Medicina Veterinaria, Vol.20, N°2, diciembre 2000
La cáscara del huevo: Un modelo de biomineralización

[ Organización estructural y composición de las cáscaras del huevo ]

La cáscara del huevo es una biocerámica com­puesta de una fase orgánica y otra inorgánica. Químicamente está compuesta de 1,6% de agua, 95,1 % de minerales, de los cuales 93,6% corresponden a carbonato de calcio en forma de calcita, 0,8% de carbonato de magnesio y 0,73% de fosfato tricálcico, y finalmente 3,3% de materia orgánica. En ella ocurre nucleación heterogénea primaria y secundaria a partir de las mamilas (Arias et al., 1991 d). Estructuralmente la cáscara de huevo de aves está constituida por cuatro capas, a saber: a) membrana de la cáscara, b) capa mamilar, c) capa en empalizada y d) cutícu­la (Fig. 1). El remanente orgánico después de la desmineralización de la capa en em­palizada constituye la matriz de la cáscara. Estos componentes se depositan sucesiva­mente a manera de una línea de ensambla­je a medida que el huevo avanza a lo largo del oviducto.

Fig. 1. Esquema de la estructua de la cáscara del huevo. m: menbranas de las cáscara; ma: mamillas; p: capa en empalizada; c: cutícula.

A. Capa de las membranas de la cáscara

Las membranas de la cáscara corresponde a la capa más interna de la cáscara del hue­vo y están formadas por un entramado fibrilar. Las fibras que las componen pesan en conjunto 145 mg, tienen un diámetro de alrededor de 70 nm (Simkiss y Taylor, 1971) y consisten en un núcleo central cubierto por un material amorfo llamado manto de dife­rente composición química (Masshoff y Stolpmann, 1961).

Las membranas de la cáscara se encuen­tran dispuestas en dos capas, una interna de 20 μm de grosor que está en contacto con la albúmina y otra externa de 50 μm de gro­sor que está situada entre la zona mineralizada de la cáscara y la membrana interna. Estas dos membranas están en ínti­mo contacto en toda su extensión, excepto a nivel de la cámara de aire donde se encuen­tran separadas (Simkiss, 1968; Wilburn y Simkiss, 1968; Parson, 1982).

Cada membrana está formada por una red de fibras orgánicas dispuestas sobre la albú­mina en una disposición paralela a la super­ficie de la cáscara. En un corte transversal cada fibra está compuesta por un centro pro­teico rodeado por un manto de mucopolisacáridos. El manto está separado del centro o núcleo por un espacio de 0,1 μm de espesor, en este espacio se encontrarían los escasos lípidos de la membrana de la cáscara (Candlich, 1972). Los centros de las fibras de la membrana son de 23 μm de lon­gitud y sus extremos se superponen con los extremos de sus vecinas, compartiendo un manto común de 6 μm El diámetro de las fibras internas es de un promedio de 0,9 μ m con un máximo de 1,5 μm . En la membrana externa la longitud de las fibras es de 15 pm con un diámetro de 1-3 μm (Simons y Wiertz, 1963; Simons, 1971).

La parte orgánica de las membranas de la cáscara está constituida por 3% de lípidos, 2% de azúcares y 95% de proteínas. La naturaleza de las proteínas ha sido motivo de muchas controversias. Los primeros es­tudios sugirieron la presencia de queratina (ovoqueratina) (Simons y Wiertz, 1963; Krampitz y Engels, 1975), lo que fue cues­tionado por evidencias basadas en la pro­piedad de solubilidad y estructura (Vadhera et al., 1971). Actualmente se acepta que la queratina no es un componente de las mem­branas (Arias et al., 1991 a).

Por otra parte, la presencia de colágeno fue sugerida por el aislamiento de hidroxilisina de las membranas de la cáscara (Candlish y Scougáll, 1969). Posteriormente se inmunodetectó la presencia de colágeno tipo I, predominantemente en las fibras gruesas de las membranas de la cáscara externa y colágeno tipo V predominantemente en las fibras finas de la membrana interna (Wong, 1984). Usando tinción de orceína, Simons (1971) concluyó que la proteína elastina estaba presente en el manto de las fibras pero no en el núcleo. Se han detectado hidroxiprolina, desmosina e isodesmosina, pero la secuencia de aminoácidos es dife­rente a la elastina de mamíferos y resisten­te a la elastasa (Crombie et al., 1981; Starcher y King, 1980; Leach et al., 1981). Más recientemente se ha detectado colágeno tipo X como principal constituyen­te de las fibras de las membranas (Arias et al., 1991 a,b).

La superficie interna de la membrana interna es lisa debido a la presencia de una capa delgada y homogénea de 2,7μm de grosor (Simons y Wiertz, 1963), que impide el paso de la albúmina hacia los espacios entre las fibras. Bellairs y Boyde (1969) llaman a esta capa, membrana limitante. Estudios al micros­cópico electrónico sugieren que está com­puesta del mismo material que el manto de las fibras y se continúa con él (Simons y Wiertz, 1963; Bellairs y Boyde, 1969). Adicionalmente se ha detectado inmunocitoquímicamente laminina en esta estructura (Dieckert, 1992).

B. Capa mamilar

La capa mamilar corresponde a menos de 1/3 del grosor de la cáscara (100 μm ). Está constituida por las mamilas a partir de las cuales se inicia la mineralización. En estos sitios se desarrollan los conos, base de las columnas cristalinas, que a medida que cre­cen se fusionan con sus vecinos.

Las mamilas son pequeñas masas de ma­terial orgánico distribuidas de manera dis­creta, unidas a la superficie externa de la membrana externa. Representan los sitios de unión del depósito de cristales, los que posteriormente quedan incluidos en la capa de los conos.

Por estudios histoquímicos Simkiss y Tyler (1957) sugirieron que las mamilas consisten en un complejo proteína-mucopolisacáridos ácidos. Robinson y King (1968) encontraron que las mamilas contenían mucopo­lisacáridos neutros rodeados por una sustan­cia débilmente ácida que podrían ser sialomucinas. Más recientemente se ha de­mostrado inmunocitoquímicamente la pre­sencia de queratán sulfato en las mamilas del huevo de gallina, codorniz, faisán y pavo, mientras que condroitin-6-sulfato se demues­tra en las mamilas del huevo de gallineta (pin­tada) y pato (Arias et al., 1992; Pan heleux et al., 1999). Este queratán sulfato forma parte de un proteoglicano llamado mamilán, cuyo núcleo proteico aún no se encuentra carac­terizado del todo (Fernández et al., 2000).

Es a partir de estas mamilas que se inicia la mineralización por el depósito de cristales de calcita. El crecimiento de estos cristales hacia el interior del huevo está limitado por las membranas de la cáscara (Arias et al., 1991 a).

Dieckert et al (1989) distinguen dentro de la mamila una zona basa¡, en contacto con las membranas de la cáscara, llamada región de reserva de calcio (CRA: calcium reserve assembly) y por sobre esta región la coro­na. La CRA representa la fuente de calcio primaria del embrión. Dentro del CRA se distingue una placa basal (BS: basal plate), que es la porción en íntimo contacto con la membrana de la cáscara externa, y un cuer­po de reserva de calcio (CRB: calcium re­serve body). La CRA es la zona de la mami­la que sufre la descalcificación a partir de la segunda mitad del desarrollo del embrión, lo que demuestra su calidad de reservorio de calcio (Dieckert et al., 1993).

La estructura y la conformación de la capa mamilar son los factores determinantes de la solidez de la cáscara. Existe, en efecto, una correlación entre la densidad de las mamilas (n° de mamilas por cm2) y la solidez de la cáscara (Fujii, 1974; Parson, 1982).

C. Capa en empalizada

Esta capa corresponde a la capa más grue­sa de la cáscara de huevo (200-350 μm ) y está compuesta por componentes orgáni­cos e inorgánicos en forma integrada. El componente inorgánico corresponde a car­bonato de calcio en forma de calcita y el componente orgánico (matriz de la cásca­ra) que corresponde al 2-5% (peso seco) es en un 2% proteico.

Estudios morfológicos y cristal ográficos re­velan tres subzonas (Terepka, 1963; Perrot et al., 1981; Sharp y Silyn Roberts, 1984): Zona de los conos: Es la zona más interna y está formada por cristales que no presen­tan una orientación preferencia¡. Los crista­les de esta zona son los primeros en depo­sitarse durante la formación de la cáscara. Zona central: En esta zona, los cristales adoptan una orientación más preferencia¡. Entre los cristales se encuentran abundan­tes vesículas.

Zona externa o de cristales verticales. Esta zona tiene un grosor de 3-8 μm y en ella se encuentra una orientación vertical de los cristales. Se ha sugerido que en esta zona el depósito de calcio se haría en ausencia de matriz (Fujii, 1974; Arias et al., 1991 d). Sin embargo recientemente se ha descrito que en esta zona la matriz orgánica cambia de la disposición paralela rica en vesículas de 450 nm de diámetro de la capa central a una matriz orientada perpendicular a la su­perficie de la cáscara, esta matriz se hace más estrechamente empaquetada en la interfase entre la capa de los cristales verti­cales y la cutícula (Dennis et al., 1996, Fraser et al., 1998).

La cáscara posee poros que permiten el intercambio gaseoso, y que resultan de la falta de sellamiento entre columnas crista­linas vecinas. Los poros atraviesan verti­calmente esta capa. Tienen forma de em­budo con su base amplia dirigida hacia la superficie y presentan un diámetro, en el extremo que enfrenta las membranas de la cáscara, de 6 μm y de 65 μmen el extre­mo que enfrenta la cutícula. Se estima que el número de estos varía entre 100-300 por cm2 de cáscara.

La materia orgánica representa sólo el 3% de los componentes de I capa en empaliza­da. Su composición está dado por un 70% de proteínas, 11% de polisacáridos y algo de lípidos (Simkiss y Tyler, 1957). El análi­sis aminoacídico sugiere la presencia de una proteína no colagenosa parecida a la que se asocia a condroitín sulfato en cartílago (Backer y Balch, 1962). Muchos componen­ tes de la matriz son característicos de los sistemas que unen calcio. Se sabe que la matriz de la cáscara de huevo es capaz de quelar iones gracias a su contenido en mucopolisacáridos y que estos se encuen­tran en la mayoría de los sitios donde ocu­rre calcificación (Simkiss y Tyler, 1958). Se ha encontrado un polipéptido, llamado ovocalcina, que une calcio desde la matriz de la cáscara de huevo (Krampitz et al., 1980). Sin embargo, éste no ha sido carac­terizado. Posteriormente Hincke et al. (1992) por medio de técnicas electroforéticas, han puesto en evidencia otras proteínas cuyo peso molecular varía entre 14 y 200 kDa, de las cuales una ha sido aislada (Hincke et al., 1995) correspondiendo a la proteína de 17 kDa u ovocleidina. Esta proteína está compuesta mayoritariamente por tres aminoácidos: glicina, arginina y alanina (Mann, 1999; Mann y Siedler, 1999). Con­juntamente con estos componentes se han descrito otras proteínas como la osteopontina, que es característica del hue­so (Pnes et al., 1994; Lavelin et al., 1998), junto a ovoalbúmina, ovotransferina y lisozima, que parecen provenir de la clara (Hincke, 1995; Gautron et al., 1997) pero cuya función en la mineralización de la cás­cara es discutible.

Con respecto a los polisacáridos de la ma­triz orgánica de la cáscara estos están constituidos preferentemente por glucosamina, galactosamina, manosa, fucosa lo que habría sugerido la presencia de condroitín sulfato (Backer y Balch, 1962). Sin embargo se ha detectado me­diante anticuerpos monoclonales sólo la presencia de dermatán sulfato en la matriz de la cáscara de huevo, no encontrándose evidencias de condroitín-4-sulfato ni condroitín-6-sulfato en la cáscara de hue­vo de gallina (Arias et al., 1992, Carrino et al., 1996, 1997). Sin embargo, condroitin­6-sulfato es el componente principal de la matriz de la cáscara del huevo de la codor­niz (Panheleux et al., 1999). El dermatán sulfato de la matriz de la cáscara forma parte de un proteoglicano llamado ovoglican (Fernández et al., 2000), que po­see un núcleo proteico de 116 kDa (Carrino . et al., 1996, 1997; Hincke et al., 1999) y cadenas del glicosaminoglicano de 22 kDa.

D. Cutícula

La cutícula es la capa más externa del hue­vo. Está compuesta de glicoproteínas y en ella se encuentran los pigmentos respon­sables de la coloración de la cáscara. Su grosor es de 10 μm en promedio y cubre los poros preservando el interior del huevo de la contaminación microbiana. La región más interna de la cutícula tiene agregados esféricos de cristales en forma de aguja que corresponden a hidroxiapatita (Dennis et al., 1996; Fraser et al., 1999). Los pigmentos de las cáscaras coloreadas (porfirinas) se encuentran en su gran ma­yoría en la cutícula y en algunas especies alcanzan la zona superficial de la capa calcificada. Al microscopio electrónico de barrido la cutícula muestra fisuras, con as­pecto de barro seco, producto de la deshi­dratación y la oxidación de los grupos SH de las proteínas presentes en ella.

Según Wedral et al. (1974) su composi­ción es de un 85-87% de proteínas, 3,5­4,4% de carbohidratos y 2,5-3,5% de lípidos. La mayor parte de las proteínas que la componen son insolubles en el agua y cloruro de potasio. Como aminoácidos mayoritarios se encuentran ácido glutámico, ácido aspártico, glicina y arginina. Como parte de su composición glucocídica se encuentran: galactosa, manosa, glucosa, fucosa, ácido siálico y galactosamina (Baker y Balch, 1962). La ausencia de ácido urónico sugiere que no habría mucopolisacáridos ácidos. Sin em­bargo, queratan sulfato un proteoglicano de queratán sulfato, aunque no necesa­riamente idéntico al descrito en las mamilas, se ha encontrado en la cutícula (Arias y Fernández, 1995).

La cutícula tiene una estructura vesicular (Simons, 1971) y sirve como defensa a la invasión bacteriana sin embargo su princi­pal rol parece ser proteger al huevo de la perdida excesiva de agua por un mecanis­mo que depende de la humedad ambiental (Peebles y Brake, 1986; Peebles et al., 1987). Por otra parte es la responsable de terminar el depósito de calcio en la capa en empalizada (Nys et al., 1999). Se depo­sita sobre todo el huevo inmediatamente antes de la ovipostura (Board y Fuller, 1994).



© Sitio desarrollado por  SISIB :: UNIVERSIDAD DE CHILE, 2004